体外诊断卡塑料卡壳只需一化学试剂，重复性好，容易掌握；而双脱氧法需单链模板、特异的寡核苷酸引物及高质量的DNA聚合酶，便随着M13噬菌体载体的发明和运用，合成的引物容易获得，测序技术不断改进，故此法已被广泛应用。基脱氧法的自动激光荧光测序仪，使测工作更快速和简便，而且保证高度重复性。至于RNA测序现大多采用将mRNA逆转录成cDNA后同测序，然后反推RNA序列

 

聚合酶链反应技术

 

 

聚合酶链反应技术简称体外诊断卡卡壳，是一种利用DNA变性和复性原理在体外进行特定的DNA片断高效扩增的技术，可检出微量靶序列（甚至少到1个拷贝）。在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。仅需用极少量模板，在一对引物介导下，在数小时 内可扩增至100万-200万份拷贝。新冠病毒保存管反应分三步：变性、退火及延伸。以上三步为一循环，每一循环的产物作为下一个的模板，这样经过九小时的循环，每一循环的产物作为下一个循环的模板，这样经过数上时的循环后，可得到大量复制的特异性DNA片段。反应条件一般为94℃变性30秒，55℃退火30秒，70-72℃延伸30-60秒，共进行30次循环左右，最后再延伸72℃5分钟，4℃冷却终止反应。

 

1.逆转录新冠病毒保存管(RT-新冠病毒保存管)用来扩增RNA的方法。

 

 

初步应用

 

有关原位体外诊断卡卡壳应用成功的第一篇报道是对感染绵羊中枢神经系统visna病毒在绵羊脉络从一细胞中检查，通过新冠病毒保存管扩增，仅用150碱基对的短探针就可通过ISH检查到了细胞内的visna病毒。从开始在试管内细胞行新冠病毒保存管扩增后再涂片做ISH(原位杂交)检查，已发展到用福尔马林固定、石蜡切片的常规病理组织方法做原位新冠病毒保存管检查。有传统的标记探针的原位新冠病毒保存管法（间接法），也有将标记物先标记新冠病毒保存管的引物，让标记物扩增后再行ISH检查的直接法。因此，目前就原位新冠病毒保存管方法而言，尚未能获得统一，也即未能比较出哪一种方法最可靠简便，各家报道的原位体外诊断卡卡壳中，在标本处理和种类上尚不同（细胞悬液、涂片、组织切片等），想检测的靶核酸也不同（病毒或体细胞的DNA或mRNA），扩增的方法上有不同（单引物、多引物），最后显示的方法也不同（直接法、间接法）。这些还都有待在今后的工作中积累经验，以求一致。

 

原位新冠病毒保存管应用的课题，目前正片于开始阶段，还很局限，对人体B细胞淋巴瘤中Ig单拷贝基因重组的检查以及对人体外周血中单核细胞HLA-DQ不同亚型的测定，归纳起来，主要应用于两方面；（1）检测外源怀基因片段，集中在病毒感染的检查上，如HIV、HPV、HBV、CMV等；（2）内源性基因片段，如人体的单基因病、重组基因、易位的染色体、Ig的mRNA片段、癌基因片段等。

 

基因转染技术

 

 

 

将特定的遗传信息传递到真核细胞中，这种能力不但革新了生物学和医学中许多基本问题的研究，也推动了诊断和治疗方面的分子技术发展，并使基因治疗成为可能。目前基因转移技术已广泛用于基因的结构和功能分析、基因表达与调控、基因治疗与转基因动物等研究。本部分将介绍目前基因转移的主要方法；重点介绍基因转移的病毒方法的基因转染（transfection）技术。

 

基因运载系统

 

将某一特定的靶基因传递到靶细胞，需要应用某一基因运载系统，目前将这一系统概括为两大类：非病毒辣方法和病毒方法。